炎症在十二指肠空肠旁路术缓解2型糖尿病中的作用及机制研究

【摘要】第一部分2型糖尿病大鼠及十二指肠空肠旁路术动物模型的建立及评价背景糖尿病是最常见的慢性病之一,其中2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)占90%以上。2011年,全球糖尿病患者总数达3.66亿,而且随着经济发展及城镇化的进展,人们生活方式的改变,糖尿病患者在不断增长,到2030年,糖尿病患者预计可达5.52亿,新增患者主要集中在中低收入国家。饮食控制、运动、口服降糖药物及注射胰岛素等传统治疗方法虽能在短期内控制血糖及其他代谢指标,由于需终生服药或注射胰岛素,患者依从性差,维持长期血糖控制的效果并不理想。减重手术在有效治疗病态肥胖的同时,可以有效缓解肥胖并发的高血压、高血脂、T2DM等代谢性并发症。研究表明,减重手术对T2DM的缓解不单单依靠其减重作用,尚存在不依赖于减重的抗糖尿病作用。虽然大量的临床研究及动物实验证实了胃旁路术对T2DM的长期、有效的治疗作用,对其缓解T2DM机制的研究形成“近端小肠假说”、“远端小肠假说”等理论,但其分子机制目前仍不清楚。目的本研究旨在建立一种新的T2DM大鼠模型,并对其实行十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunalbypass,DJB),以其做为胃旁路术的模型,对胃旁路术不依赖于减重作用的缓解T2DM的机制进行研究。本研究主要对以下问题进行研究：(1)对建立的T2DM大鼠模型进行评估,确定建立的模型能模拟人T2DM的特点；(2)评估DJB对T2DM大鼠糖代谢的影响,在本模型中验证其对糖代谢的改善作用；(3)在本模型中评估DJB对T2DM大鼠血脂指标的影响；(4)评估DJB对T2DM大鼠肠道激素的影响,对其改善糖代谢的机制进行进一步研究。方法本研究中应用高脂饲料(Highfatdiet,HFD)喂养SD大鼠1个月诱导胰岛素抵抗,然后给予低剂量(35mg/kg)的链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射诱导高血糖,此模型很好的模拟了人T2DM的发病过程及代谢特点。DJB保留了胃的完整性,其小肠重建方式与Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Ygastricbypass,RYGB)相同,对体重及摄食量没有影响,是目前用来研究胃旁路术不依赖于减重作用的抗糖尿病机制的良好模型。对成功诱导出T2DM的大鼠进行DJB及假手术(Sham-DJB,S-DJB),以正常SD大鼠作为空白对照(CON),并检测以下指标：(1)血糖：每周检测其空腹血糖及随机血糖；(2)糖耐量：在术后2,4,8,12周进行口服葡糖糖耐量实验(Oralglucosetolerancetest,OGTT)进行检测；(3)胰岛素敏感性：在术前及术后2周、12周以胰岛素耐量实验(Insulintolerancetest,ITT)进行检测；(4)β细胞功能：以术前及术后2周、12周检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌进行评估；(5)肠道激素：检测术后2周、12周葡萄糖刺激的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)、肽YY(PeptideYY,PYY)及葡萄糖依赖性促胰岛素肽(Glucosedependentinsulinotropicpeptide,GIP)的变化；(6)血脂指标：检测术后12周血清甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸的变化。结果(1)HFD联合小剂量STZ成功诱导出T2DM大鼠模型,模拟了人T2DM胰岛素抵抗(葡萄糖刺激的胰岛素水平升高及AUCITT升高)及高血糖(开始主要表现为随机血糖的升高,空腹血糖逐步升高)的特点。(2)DJB组与S-DJB组大鼠的体重及能量摄入在术前及术后均无显著性差异(*P>0.05)。(3)DJB可迅速、持久的缓解T2DM大鼠的随机血糖(*P<0.05)；S-DJB组大鼠的空腹血糖逐步升高,而DJB大鼠的空腹血糖保持在正常水平。(4)DJB可迅速、持久的改善T2DM大鼠的糖耐量,术后2周DJB组大鼠糖耐量即明显改善(AUCOGTT明显下降,*P<0.05),术后4周进一步改善,并达到与CON组相近水平。(5)DJB可迅速改善T2DM大鼠的胰岛素敏感性,DJB术后2周胰岛素敏感性即明显改善(AUCITT明显下降,*P<0.05)；术后12周DJB组大鼠胰岛素敏感性进一步改善,而S-DJB组大鼠胰岛素敏感性进一步恶化,者AUCITT差异更加明显。(6)高脂饲料喂养1个月后,SD大鼠出现高胰岛素血症。STZ腹腔注射后,胰岛素水平下降,但并未出现胰岛素缺乏,其水平与正常对照组水平相近。3组大鼠术后2周及12周葡糖糖刺激的胰岛素分泌无显著性差异。(7)术后2周及12周,DJB组大鼠葡糖糖刺激的GLP-1、PYY水平明显升高(*P<0.05),而3组大鼠葡糖糖刺激的GIP水平无明显差异(*P>0.05)。(8)3组大鼠总胆固醇无显著性差异(*P>0.05)；与S-DJB组大鼠相比,DJB组大鼠的甘油三酯及游离脂肪酸(Freefattyacids,FFA)水平明显降低(*P<0.05)。结论(1)通过高脂饲料喂养1个月联合低剂量STZ(35mg/kg)可以成功诱导T2DM大鼠模型,此模型符合人类T2DM的发病过程及代谢特点；(2)DJB对T2DM大鼠的可迅速、显著、持久的改善T2DM大鼠的随机血糖,阻止空腹血糖的升高；(3)DJB可迅速改善T2DM大鼠的糖耐量及胰岛素敏感性,而对葡萄糖刺激的胰岛素分泌无明显影响；(4)DJB手术后,葡萄糖刺激的主要由远端小肠分泌的GLP-1、PYY显著升高,GIP分泌量与术前相比无明显差别；(5)DJB手术可以显著降低T2DM大鼠的FFA及甘油三酯水平。本部分研究表明,DJB可以迅速、持久的改善T2DM大鼠的糖代谢。其对糖代谢的改善作用可能与GLP-1、PYY等肠道激素的水平升高有关。但其作用方式及机制目前仍不清楚,在下一步的研究中,我们将对其作用机制进行深入研究。第二部分十二指肠空肠旁路术对T2DM大鼠炎症状态的影响背景T2DM的发生的主要是由胰岛素抵抗及胰岛p细胞功能障碍引起,然而其具体机制目前仍不明确。近年来,炎症假说备受关注,尤其是炎症在胰岛素抵抗中的作用。大量研究表明,T2DM是一种自然免疫与低度炎症性疾病。肥胖是T2DM最重要的危险因子。肥胖时机体处于一种慢性低度炎症状态,表现为循环中炎症介质水平升高,如肿瘤坏死因子-alpha(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α),白介素-6(Interleukin-6,IL-6),C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)等。研究表明,这种慢性低度炎症状态主要起源于脂肪组织。脂肪组织不仅仅是一个储存脂质的器官,近年来的研究表明脂肪组织还是一个内分泌器官。作为一个内分泌器官,脂肪组织可以分泌多种激素及细胞因子,他们在调节糖代谢、脂代谢、凝血、饥饿及饱腹感等信号通路中起到至关重要的作用。脂肪组织分泌的细胞因子及趋化因子,统称为脂肪因子(adipokines)或脂肪细胞因子(adipocytokines),如瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、TNF-α、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)等。减重手术是目前治疗病态肥胖最有效的治疗方式。研究报道RYGB术后血清hsCRP水平降低。还有研究报道,减重手术后脂肪组织及肝脏组织中炎症因子mRNA表达水平下降。大多数研究都将机体炎症状态的缓解归结为体重减轻的结果。然而,有研究表明,RYGB术后促炎症因子水平的降低、抗炎症因子水平的升高与体重下降的幅度不相关。胃旁路术后机体炎症状态的缓解是否亦存在不依赖于体重减轻的机制,机体炎症状态的缓解与T2DM的缓解是否存在相关性,需要进一步的研究。目的近年来的研究表明,脂肪组织不单单是能量储存器官,亦是一个内分泌器官。脂肪组织可以分泌大量的细胞因子及趋化因子。脂肪组织,特别是内脏脂肪组织,是肥胖状态下机体慢性炎症状态下促炎症因子的主要来源。除脂肪组织外,肥胖状态下,肝脏组织存在大量的脂肪浸润及炎症细胞的浸润,是机体慢性炎症状态的另一个重要来源。肝脏组织与脂肪组织又是机体糖代谢的重要器官。脂肪组织、肝脏炎症水平是胰岛素抵抗发生的重要原因。本研究旨在明确DJB对T2DM大鼠机体脂肪分布、肝脏脂肪浸润、脂肪组织炎症细胞浸润及机体炎症状态等的影响,并明确机体炎症状态的变化与胰岛素敏感性的关系,以揭示DJB缓解T2DM的机制。方法本部分研究中,我们利用第一部分中取得的血液及组织样本,对以下指标进行检测：(1)机体炎症状态的变化：用术后12周取得的血液样本,对血清中血清瘦素、脂联素、超敏型C-反映蛋白(highsensitiveC-reactiveprotein,hsCRP)、TNF-α、IL-6等脂肪因子以ELISA方法进行检测；(2)机体脂肪组织分布的变化：对手术后12周取得的各部位的脂肪组织称重,计算其与体重的比例,观察不同部位脂肪沉积的变化；(3)脂肪组织中巨噬细胞浸润的变化：进行免疫组织化学染色检测腹膜后脂肪组织中F4/80阳性细胞的变化,并分离脂肪组织基质血管组分行实时荧光定量PCR检测Mac-1、F4/80、CD68等巨噬细胞标志物进一步确认脂肪组织中巨噬细胞浸润的多少；(4)肝脏组织脂肪浸润的变化：以油红O染色检测肝组织中脂肪浸润的变化；(5)脂肪组织炎症状态的变化：内脏脂肪组织瘦素、脂联素、TNF-α、IL-6、白介素1β(Interleukin-1beta,IL-1β)、MCP-1等mRNA表达的变化,以实时荧光定量定量PCR进行检测；(6)肝脏组织炎症状态的变化：肝脏组织TNF-α、IL-6,IL-1β、MCP-1等mRNA的变化,以实时荧光定量定量PCR进行检测。结果(1)S-DJB组大鼠血清中瘦素、hsCRP、IL-6较CON组明显升高,而DJB手术可以明显降低这些炎症因子的水平(*P<0.05);S-DJB组大鼠血清中抗炎性脂肪因子脂联素水平较CON组明显降低,DJB手术可以明显上调其水平(*P<0.05)。(2)DJB术后12周,3组大鼠附睾周围脂肪及腹股沟区脂肪与体重的比例无显著性差异,而DJB组大鼠内脏脂肪组织大网膜及腹膜后脂肪组织占体重的比例较S-DJB组大鼠明显降低(*P<0.05)。(3)与S-DJB组相比较,DJB术后12周,肝脏组织脂肪浸润明显减少。(4)与S-DJB组相比较,DJB术后12周,腹膜后脂肪组织中巨噬细胞标志物F4/80阳性的细胞明显减少,血管基质组分中巨噬细胞标志物Mac-3、CD68、F4/80mRNA表达量明显降低(*P<0.05)。(5)与S-DJα、B组相比较,DJB术后12周,内脏脂肪组织瘦素、TNF-IL-6.IL-1β、MCP-1等促炎性脂肪因子mRNA表达水平显著下降(*P<0.05),抗炎性脂肪因子脂联素mRNA表达水平明显升高(*P<0.05)。(6)与S-DJB组相比较,DJB术后12周,肝脏组织TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1等mRNA表达水平明显降低(*P<0.05)。(7)DJB术后12周,炎症因子的表达水平与GLP-1表达量呈负相关,与AUCITT呈正相关,与体重、进食量、胰岛素水平等因素无相关性。结论本部分的研究结果表明：(1)DJB手术后12周,T2DM大鼠循环中炎症因子水平降低,抗炎性脂肪因子-脂联素水平升高；(2)DJB手术后12周,T2DM大鼠的内脏脂肪含量降低,肝脏脂肪浸润明显减少；(3)DJB手术后12周,内脏脂肪组织中巨噬细胞浸润减少。(4)DJB手术后12周,内脏脂肪组织中炎症因子的mRNA表达水平降低,内脏脂肪组织中脂联素nRNA表达水平升高；(5)DJB手术后12周,肝脏组织中炎症因子的mRNA表达水平明显降低；(6)相关性分析显示,机体炎症状态的改善与胰岛素敏感性的改善存在相关性,与GLP-1水平的升高也存在相关性。第三部分十二指肠空肠旁路术对T2DM大鼠JNK活性及胰岛素信号通路的影响背景胰岛素受体底物(Insulinreceptorsubstrates,IRSs)是胰岛素信号通路的重要调节因子。在正常情况下,胰岛素与其受体的结合引起胰岛素受体构型的变化,这种变化引起胰岛素受体胞质域特定酪氨酸残基的磷酸化,进而引起调节蛋白IRSs的聚集。与IRS作用后,PI3K被激活。酪氨酸磷酸化是IRSs激活和胰岛素敏感性所必须的,这种作用可被IRSs丝氨酸磷酸化所阻滞。TNF-a与其受体结合,可以激活色氨酸激酶如c-JunN-末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)及色氨酸激酶抑制物κB激酶(serinekinaseinhibitorkBkinase,IKK)等。这些色氨酸激酶可以引起IRSs色氨酸的磷酸化,阻滞胰岛素信号通路的传导,引起胰岛素抵抗。近年来的研究表明T2DM是一种慢性炎症性疾病。炎症因子及游离脂肪酸可以激活细胞内信号通路,如JIK、IKKβ等。这些信号通路在胰岛素抵抗及T2DM的发生、发展中起着至关重要的作用。JNK可以使胰岛素受体底物307位的丝氨酸(Ser307)发生磷酸化,而其正常的酪氨酸磷酸化受到抑制,而影响下游胰岛素信号的转导。研究表明RYGB可以上调肥胖T2DM大鼠肝脏胰岛素受体、IRS及其酪氨酸磷酸化的表达。本课题组的一项研究表明DJB可以上调GK大鼠肝脏胰岛素信号相关蛋白的表达。然而,目前还没有DJB对JNK及IRSsSer307磷酸化表达水平影响的报告,也没有其在DJB术后胰岛素敏感性改善中的作用及机制的报道。目的我们的前期研究已表明DJB术后机体的慢性炎症状态得到改善,血清、内脏脂肪、肝脏的炎症因子表达水平均显著下降,而且其慢性炎症状态的改善与胰岛素敏感性的改善呈正相关关系。因为炎症因子可以激活胰岛素信号转导相关的细胞内信号通路,在调节胰岛素敏感性方面发挥着至关重要的作用。我们在本部分研究中将对内脏脂肪组织及肝脏组织JNK活性进行检测,并对其相关的胰岛素信号转导通路中的关键蛋白进行研究,以明确其在DJB术后炎症状态的改善对胰岛素敏感性影响。方法应用第一部分中取得的组织样本,以Westernblotting技术对以下指标进行检测：(1)内脏脂肪组织中JNK,p-JNK的表达变化；(2)内脏脂肪组织中总IRS-1及IRS-1P-ser307的表达；(3)肝脏中JNK、p-JNK的表达变化；(4)肝脏组织中总IRS-2及IRS-2p-ser307的表达；(5)以免疫共沉淀技术检测肝脏组织及内脏脂肪组织中IRS1/2结合的PI3K的变化。结果(1)与S-DJB组相比,DJB组大鼠内脏脂肪组织中JNK表达有下降趋势,但并未达到显著性差异(P>0.05),但p-JNK/JNK比例明显下降(*P<0.05)。(2)与S-DJB组相比,DJB组大鼠内脏脂肪组织中IRS-1的表达量无显著性差异(P>0.05),然而IRS-lp-ser307/IRS-1比例明显下降(*P<0.05)。(3)与S-DJB组相比,DJB组大鼠肝脏组织中JNK及p-JNK的表达水明显平均下降(*P<0.05)。(4)与S-DJB组相比,DJB组大鼠肝脏组织中IRS-1表达明显升高(*P<0.05),而IRS-1p-ser307/IRS-1比例明显下降(*P<0.05)。(5)与S-DJB组相比,DJB组大鼠内脏脂肪组织及肝脏组织中IRS-1/2结合的PI3K水平均明显升高(*P<0.05)。结论本部分的实验结果表明：(1)DJB手术后12周,T2DM大鼠内脏脂肪组织中JNK活性下降；(2)DJB手术后12周,T2DM大鼠脂肪组织中胰岛素信号通路转导得到明显改善；(3)DJB手术后12周,T2DM大鼠脏肝脏组织中JNK活性下降；(4)DJB手术后12周,T2DM大鼠肝脏组织中胰岛素信号通路得到了明显改善。
【作者】胡春晓；
【导师】胡三元；
【作者基本信息】山东大学，外科学，2014，博士
【关键词】十二指肠空肠旁路术；2型糖尿病；高脂饮食；链脲佐菌素；肠道激素；十二指肠-空肠旁路术；炎症；胰岛素抵抗；胰高血糖素样肽-1；胰岛素敏感性；c-JunNH2-末端激酶；胰岛素信号；

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